การเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นใน DNA จะทำให้ลักษณะของสิ่งมีชีวิตเปลี่ยนแปลงไป การเปลี่ยนแปลงของสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะเปลี่ยนไปจากบรรพบุรุษ และสามารถถ่ายทอดลักษณะนี้ไปยังรุ่นต่อไป ทำให้ลูกหลานที่เกิดขึ้นมีลักษณะแตกต่างจากบรรพบุรุษ แล้วสามารถมีชีวิตอยู่รอดในสภาพแวดล้อมที่ต่างกันในระยะเวลาที่ยาวนาน เรียกว่า วิวัฒนาการ (evolution)

อย่างไรก็ดี ถ้าสิ่งมีชีวิตในปัจจุบันมีวิวัฒนาการ คือ มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างลักษณะมาจากสิ่งมีชีวิตในอดีตจริง ก็จะต้องมีหลักฐานยืนยันการเปลี่ยนแปลงเหล่านั้นได้ โดยหลักฐานต่างๆ ที่สนับสนุนการเปลี่ยนแปลงนั้น ได้แก่

1. หลักฐานซากดึกดำบรรพ์ของสิ่งมีชีวิต

เมื่อพืชหรือสัตว์ตายลง มักจะถูกย่อยสลายจนไม่มีซากที่สมบรูณ์เหลืออยู่ โดยเฉพาะซากสิ่งมีชีวิตที่มีอายุนับล้านปี แต่ในบางครั้งซากของสิ่งมีชีวิตเหล่านี้ยังคงเหลืออยู่ในรูปของซากดึกดำบรรพ์ (fossil) เช่น โครงกระดูกไดโนเสาร์ รอยเท้าสัตว์ รอยพิมพ์ใบไม้ ต้นไม้ที่กลายเป็นหิน หรือซากแมลงในอำพัน 

ซากดึกดำบรรพ์เปรียบเสมือนการบันทึกเหตุการณ์ที่สนับสนุนว่า สิ่งมีชีวิตเหล่านี้เคยปรากฏอยู่บนโลกในอดีต แต่ในปัจจุบันสิ่งมีชีวิตหลายชนิดได้สูญพันธุ์ไปแล้ว เช่น ไดโนเสาร์ เป็นต้น แต่สิ่งมีชีวิตบางชนิด เช่น แมงดาทะเล ยังมีลักษณะใกล้เคียงกับที่พบในปัจจุบัน จากการศึกษาซากดึกดำบรรพ์ในหินตะกอนชั้นต่างๆ พบซากดึกดำบรรพ์ในหินแต่ละชนิดแตกต่างกัน

นักวิทยาศาสตร์สามารถคาดคะเนอายุของซากดึกดำบรรพ์ได้ จากอายุของชั้นหินตะกอนที่ซากดึกดำบรรพฝังตัวอยู่ ดังนั้น หลักฐานซากดึกดำบรรพ์สามารถบอกลำดับการเกิดของสิ่งมีชีวิตบนโลก โดยซากดึกดำบรรพ์ที่มีอายุมากกว่า จะอยู่ในชั้นหินล่างที่มีอายุมากกว่า และซากดึกดำบรรพ์ที่มีน้อยกว่า จะพบอยู่ในหินชั้นบนที่มีอายุน้อยกว่า

นอกจากนี้ ซากดึกดำบรรพ์ที่มีอายุน้อยกว่า จะมีโครงสร้างที่ซับซ้อน และมีลักษณะใกล้เคียงกับสิ่งมีชีวิตในปัจจุบันมากกว่าซากดึกดำบรรพ์ที่มีอายุมาก ซากดึกดำบรรพ์นอกจากจะเป็นหลักฐานที่แสดงให้เห็นถึงลำดับการเกิดวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิตแล้ว ยังเป็นหลักฐานที่บ่งชี้ให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงของสิ่งมีชีวิตจากอดีตจนถึงปัจจุบันอีกด้วย

2. หลักฐานจากกายวิภาคเปรียบเทียบ

การศึกษาเปรียบเทียบของโครงสร้างต่างๆ ในตัวเต็มวัยของสิ่งมีชีวิตต่างสปีชีส์กัน แม้บางครั้งจะดูภายนอกแตกต่างกันมาก แต่เมื่อตรวจดูโครงสร้างกระดูก และกล้ามเนื้อซึ่งอยู่ภายในแล้ว พบว่ามีลักษณะคล้ายคลึงกัน เช่น ขาสุนัข-ขาม้า, ปีกนก-ครีบวาฬ เรียกว่า homologous structure คือ โครงสร้างมาจากจุดกำเนิดเดียวกัน แต่ทำหน้าที่ต่างกัน วิวัฒนาการของโครงสร้างนี้เรียกว่า homology

การที่มีจุดกำเนิดเดียวกันแสดงว่า สิ่งมีชีวิตกลุ่มนี้มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกันในเชิงวิวัฒนาการ คือ มีบรรพบุรุษร่วมกัน เช่น ของรยางค์คู่หน้าในสัตว์มีกระดูกสันหลัง ซึ่งจะแตกต่างกันในเรื่องขนาด รูปร่าง และหน้าที่ แต่มีแบบแผนของโครงสร้างคล้ายคลึงกัน

ส่วน analogous structure คือ โครงสร้างของสิ่งมีชีวิตที่มาจากจุดกำเนิดต่างกัน แต่ทำหน้าที่เหมือนกัน เรียกวิวัฒนาการของโครงสร้างนี้ว่า analogy ในเชิงวิวัฒนาการสิ่งมีชีวิตกลุ่มนี้ไม่มีความสัมพันธ์กันทางบรรพบุรุษ

3. หลักฐานจากคัพภวิทยาเปรียบเทียบ

ในบางกรณีที่ไม่สามารถศึกษากายวิภาคเปรียบเทียบในระยะตัวเต็มวัยได้ แต่เมื่อศึกษาการเจริญเติบโตในระยะเอ็มบริโอแล้ว พบว่าใช้เป็นหลักฐานสนับสนุนการเกิดวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิตได้

จากการศึกษาการเจริญเติบโตของเอ็มบริโอของสัตว์มีกระดูกสันหลังระยะแรกๆ จะเห็นว่ามีอวัยวะบางส่วนที่คล้ายคลึงกัน เช่น ช่องเหงือก (gill slit) และหาง เป็นต้น ความคล้ายคลึงกันของการเจริญเติบโตในระยะเอ็มบริโอนี้ อาจเป็นไปได้ว่าสัตว์มีกระดูกสันหลังเหล่านี้ ต่างมีวิวัฒนาการมาจากบรรพบุรุษเดียวกัน แต่มีการปรับเปลี่ยนรูปร่างอันเป็นผลมาจากการวิวัฒนาการเพื่อให้เหมาะสมต่อการดำรงชีวิตในสภาพแวดล้อมที่แตกต่างกัน

4. หลักฐานด้านชีววิทยาระดับโมเลกุล

จากการศึกษาอัตราของมิวเทชั่นที่เกิดขึ้นในสภาวะที่เป็นธรรมชาติของ DNA พบว่าอัตราการเกิดมิวเทชั่นต่ำมากและค่อนข้างคงที่ การเปลี่ยนแปลงของกรดอะมิโนแต่ละโมเลกุลที่เกิดขึ้นในสายของโปรตีนกินเวลาหลายล้านปี เช่น การเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนในไซโตโครมซี 1 โมเลกุล ใช้เวลานานถึง 17 ล้านปี คนจึงเริ่มแตกต่างจากลิงซีรัสเมื่อ 17 ล้านปีมาแล้วเพราะมีกรดอะมิโนแตกต่างกัน 1 โมเลกุล

ดังนั้น สิ่งมีชีวิตที่มีความใกล้ชิดทางสายวิวัฒนาการจะมีความแตกต่างของนิวคลีโอไทด์น้อย และถ้าแตกต่างกันมากจะมีสายวิวัฒนาการแตกต่างกันมากขึ้น จากการศึกษาพบว่า ลิงซิมแพนซีมีความใกล้ชิดกับคนมากที่สุด

ตารางแสดงจำนวนกรดอะมิโนที่แตกต่างกันในไซโตโครมซีของสิ่งมีชีวิต

5. หลักฐานทางชีวภูมิศาสตร์

ภูมิอากาศและภูมิประเทศ เป็นตัวกำหนดที่ทำให้มีการกระจายของพืชและสัตว์แตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับความเหมาะสมของสภาพแวดล้อมนั้นๆ สิ่งกีดขวางต่างๆ เช่น ภูเขา ทะเลทราย ทะเลมหาสมุทร เป็นผลให้มีการแบ่งแยก และเกิดสปีชีส์ในที่สุด

เช่น การเกิดสปีชีส์ของกุ้งที่ต่างกัน 6 สปีชีส์ จากเดิมที่มีเพียงสปีชีส์เดียว แต่การเปลี่ยนแปลงและการเคลื่อนขยับของแผ่นทวีปทำให้กุ้งเหล่านี้ถูกแยกจากกันโดยสภาพทางภูมิศาสตร์ และต่างก็ต้องปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อม เมื่อเวลาผ่านไปลักษณะความแตกต่างจึงเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ จนไม่อาจผสมพันธุ์กันได้อีก เกิดเป็นกุ้งต่างสปีชีส์ขึ้น