ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชและเครื่องมือเครื่องใช้

      ปัญหาพื้นฐานในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชโดยทั่วไป คือ การปนเปื้อนของจุลินทรีย์ซึ่งก่อให้เกิดความสูญเสียเป็นอันมาก ทั้งด้านวัสดุ แรงงาน และเวลา แม้ไม่ใช่เรื่องสุดวิสัยในการป้องกันแต่ก็เป็นเรื่องละเอียดอ่อนที่ต้องใช้ความสังเกตติดตามขั้นตอนต่าง ๆ เพื่อหาสาเหตุที่มาของการปนเปื้อนอันนำไปสู่การป้องกันและแก้ไขให้ตรงจุด  การลดปัญหาดังกล่าวอาจเริ่มตั้งแต่การจัดบริเวณพื้นที่การทำงานให้เป็นสัดส่วนเพื่อแยกบริเวณที่มีสิ่งสกปรกที่เป็นแหล่งของจุลินทรีย์มิให้ปะปนกับบริเวณที่ปลอดเชื้อแล้ว เช่น วัสดุอุปกรณ์ พื้นที่เตรียมอาหารควรแยกออกจากห้องย้ายเนื้อเยื่อ และห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชซึ่งรักษาความสะอาดเป็นอย่างดีและสม่ำเสมอ  บุคคลที่ปฏิบัติงานต้องระมัดระวังไม่นำฝุ่นละออง เชื้อโรค แมลง รวมทั้งอาหารเข้าไปในห้องปฏิบัติการวัสดุอุปกรณ์เครื่องใช้ต่าง ๆ ที่เกี่ยวข้อง และเนื้อเยื่อพืชควรผ่านการฆ่าเชื้อด้วยวิธีการที่เหมาะสม เช่น เครื่องแก้ว เครื่องมือโลหะ ควรผ่านการอบด้วยความร้อนแห้งที่อุณหภูมิ ๑๘๐ องศาเซลเซียส นาน ๓ ชั่วโมง อาหารสังเคราะห์และน้ำกลั่นควรนึ่งด้วยหม้อนึ่งอัดไอน้ำ (autoclave) ที่อุณหภูมิ ๑๒๑ องศาเซลเซียส ความดัน ๑๕ ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลาอย่างน้อย ๑๕ - ๒๐ นาที กรณีที่สารประกอบจะมีสมบัติเปลี่ยนแปลงไปเนื่องจากการใช้ความร้อน เช่น จิบเบอเรลลินส์ ซีเอทิน แอบซิสซิกแอซิด ควรทำให้ปลอดเชื้อโดยการกรองด้วยชุดกรองที่สามารถแยกจุลินทรีย์ออกได้  ส่วนบริเวณที่ปฏิบัติการย้ายเนื้อเยื่อพืชไม่ว่าจะเป็นห้องหรือตู้ย้ายเนื้อเยื่อ  นอกจากการรักษาความสะอาดทั่วไปแล้วมักเปิดไฟที่ให้รังสีอัลตราไวโอเลต (UV) เป็นเวลา ๒๐ นาที ก่อนการใช้งานแต่ต้องใช้อย่างระมัดระวังเนื่องจากรังสีดังกล่าวอาจเป็นอันตรายต่อผิวหนังและดวงตา  การใช้เอทิลแอลกอฮอล์ ๗๐% เช็ดบริเวณภายในตู้ย้ายเนื้อเยื่อจะช่วยลดการปนเปื้อนจากจุลินทรีย์ได้ส่วนหนึ่ง เครื่องมือ เช่น ปากคีบและใบมีด อาจฆ่าเชื้อโดยการจุ่มในเอทิลแอลกอฮอล์ ๙๕% แล้วเผาไฟ  ส่วนเนื้อเยื่อพืชควรทำความสะอาดกำจัดสิ่งสกปรกออกก่อนแล้วจึงนำมาฆ่าเชื้อที่ติดอยู่ตามผิวของชิ้นเนื้อเยื่อด้วยสารเคมีซึ่งควร พิจารณาเลือกใช้ให้เหมาะสมกับลักษณะของเนื้อเยื่อ เช่น เช็ดด้วยเอทิลแอลกอฮอล์หรือแช่ในน้ำยาฟอกขาวที่มีส่วนประกอบของโซเดียมไฮโพคลอไรต์ (sodium hypochlorite) ที่นำมาเจือจางให้เหลือประมาณร้อยละ ๕ - ๓๐ และเติมสารลดความตึงผิว เช่น ทวิน ๒๐ (tween 20) ประมาณ  ๒ - ๓ หยด แช่เนื้อเยื่อพืช เป็นเวลา ๑ - ๒๐ นาที จากนั้นล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้วอย่างน้อย ๓ ครั้ง ก่อนนำมาตัดแยกเพื่อนำเอาเฉพาะเนื้อเยื่อส่วนที่ต้องการและสมบูรณ์ดีไปเพาะเลี้ยงในอาหารที่เตรียมไว้  ผู้ปฏิบัติงานก็ต้องรักษาความสะอาดผม เสื้อผ้า และร่างกายเป็นอย่างดี โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มือและแขนหลังจากล้างด้วยสบู่และน้ำแล้วควรเช็ดด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ ๗๐%

      ด้วยเนื้อเยื่อพืชที่ย้ายลงในอาหารสังเคราะห์แล้ว  มักเลี้ยงไว้ในห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชที่ควบคุมให้มีความสะอาดอยู่เสมอเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ในระหว่างการเพาะเลี้ยง การควบคุมปัจจัยแวดล้อมอื่น ๆ ได้แก่ อุณหภูมิภายในห้องซึ่งโดยทั่วไปจะรักษาระดับให้อยู่ที่ประมาณ ๒๕ องศาเซลเซียส  ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่พืชทั่ว ๆ ไปเจริญได้ดี  แสงเป็นอีกปัจจัยหนึ่งที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อและอวัยวะของพืช แสงในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมักเป็นแสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์ที่มีช่วงคลื่นแสงสีแดงค่อนข้างมาก  ติดตั้งไว้เหนือชั้นวางขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชโดยให้มีความเข้มแสงประมาณ ๑,๐๐๐-๒,๐๐๐ ลักซ์ ความเข้มแสงระดับดังกล่าวเพียงพอสำหรับการควบคุมการเจริญของเนื้อเยื่อพืช แต่การสังเคราะห์ด้วยแสงอาจถูกจำกัดอยู่ระดับหนึ่งดังนั้นในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจึงได้เติมน้ำตาลและสารที่จำเป็นเสริมให้เนื้อเยื่อพืชเพื่อชดเชยให้เพียงพอสำหรับการเจริญเติบโต  การเพิ่มความเข้มแสงมีผลให้อุณหภูมิสูงขึ้นซึ่งนอกจากจะสิ้นเปลืองพลังงานแล้ว ยังทำให้เครื่องปรับอากาศทำงานหนักอีกด้วย 

      แม้ว่าการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมักจะเลี้ยงในสภาพควบคุมให้อุณหภูมิและความเข้มแสงต่ำดังได้กล่าวมาแล้ว  แต่เมื่อถึงระยะการเตรียมพืชก่อนการย้ายปลูกจำเป็นต้องมีการเพิ่มอุณหภูมิและความเข้มแสงซึ่งมีจุดประสงค์ให้พืชได้ปรับตัวให้พร้อมสำหรับการเปลี่ยนสภาพจากในห้องเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมาอยู่ในสภาพธรรมชาติที่แตกต่างกันโดยสิ้นเชิง  การเตรียมพืชก่อนการย้ายปลูกเช่นนี้มีผลให้อัตราการรอดสูงขึ้น  ส่วนความชื้นในขวดเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนั้นถ้าเป็นอาหารที่เตรียมใหม่ ๆ แม้เป็นอาหารวุ้นก็ตาม ความชื้นสัมพัทธ์ของบรรยากาศภายในขวดจะสูงถึง ๑๐๐% ซึ่งสังเกตได้จากไอน้ำที่เกาะอยู่ทั่วไปภายในขวด ความชื้นทั้งในบรรยากาศและในอาหารภายในขวดจะลดลงเมื่อเวลาผ่านไป  ดังนั้นในกรณีของการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชที่บอบบางและแห้งตายได้ง่าย เช่น เนื้อเยื่อเจริญจากปลายยอดมักเริ่มด้วยการเลี้ยงในอาหารเหลวที่เตรียมขึ้นใหม่ ๆ ก่อน ซึ่งอาจมีการเพิ่มออกซิเจนให้ด้วยการวางบนเครื่องเขย่าหรือกลิ้งขวดเบา ๆ หรือมีวัสดุพยุงเนื้อเยื่อไว้ไม่ให้จมอยู่ใต้อาหารเหลว เมื่อเนื้อเยื่อพืชปรับตัวได้และเริ่มเจริญดีแล้วจึงย้ายลงเลี้ยงในอาหารวุ้นต่อไป อนึ่ง ปริมาณวุ้นในอาหารที่สูงกว่าร้อยละ ๘ อาจมีผลให้อาหารค่อนข้างแข็งและเนื้อเยื่อพืชดูดน้ำจากอาหารได้ลดลง ทั้งนี้  การแข็งตัวของวุ้นยังขึ้นกับความเป็นกรดด่างของอาหารด้วยจึงมักปรับค่า pH ให้อยู่ที่ประมาณ ๔.๘ - ๖.๐ ซึ่งที่ระดับ pH  ดังกล่าว แร่ธาตุ วิตามิน และฮอร์โมนที่จำเป็นสำหรับพืชจะอยู่ในสภาพคงตัวให้พืชใช้ประโยชน์ได้ครบถ้วน