4,519 Views
Favorite
โดยหลักการแล้วขั้นตอนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชที่สำคัญ มีดังนี้
๑. เลือกส่วนของพืชที่ต้องการ เพื่อนำมาเลี้ยงด้วยวิธีที่เหมาะสม โดยรักษาสภาพเนื้อเยื่อหรืออวัยวะนั้นให้อยู่ในสภาพที่สามารถเจริญเติบโตต่อไปได้
๒. จัดเตรียมอาหารสังเคราะห์และสภาพแวดล้อมที่เหมาะสม สำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เลือกไว้เพื่อให้มีการเจริญเติบโตได้ตามจุดมุ่งหมาย
๓. กำจัดเชื้อที่ติดมากับส่วนของพืช อาหารสังเคราะห์ อุปกรณ์ที่ใช้ ตลอดจนสภาพแวดล้อมในการเลี้ยง ให้อยู่ในสภาวะปลอดเชื้อกล่าวคือให้ปราศจากจุลินทรีย์ เช่น แบคทีเรีย รา ฯลฯ ที่อาจปนเปื้อน ทั้งนี้เพื่อป้องกันผลกระทบจากจุลินทรีย์เหล่านั้นที่นอกจากจะแย่งอาหารแล้วยังอาจสร้างสารยับยั้งหรือรบกวนการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อพืชอีกด้วย
เนื่องจากการเลือกส่วนของพืชที่จะนำมาเลี้ยงมีผลโดยตรงต่อความสำเร็จในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ดังนั้นการเลือกส่วนของพืชจึงเป็นสิ่งแรก ๆ ที่ควรพิจารณาซึ่งต้องใช้ความรู้เกี่ยวกับส่วนต่าง ๆ ของพืชว่าประกอบด้วยเซลล์และเนื้อเยื่อที่มีสมบัติแตกต่างกันทั้งในด้านลักษณะและภาวะทางสรีรวิทยา การเจริญเติบโตหรือในบางกรณีจำนวนชุดของโครโมโซมภายในเซลล์อันส่งผลต่อ การเจริญที่คาดว่าจะได้รับ ตัวอย่างเช่น เนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอดทำหน้าที่แบ่งเซลล์เพื่อการเติบโตของยอดตามธรรมชาติ เมล็ดมีเอ็มบริโอที่พร้อมจะเจริญเป็นต้นกล้าส่วนต่าง ๆ ของต้นกล้า ประกอบด้วยเนื้อเยื่อที่ยังอ่อนอยู่และกำลังมีการเจริญตาข้างบนลำต้นจะเจริญไปเป็นกิ่ง ตลอดจนช่อดอกอ่อนเหล่านี้ก็สามารถนำมาเลี้ยงและให้ผลดีกว่าส่วนของพืชที่มีการเจริญจำกัด เช่น แผ่นใบ กลีบดอก เนื้อ และเปลือกผล ซึ่งเมื่อนำมาเลี้ยงอาจเติบโตได้เพียงระยะเดียวเว้นแต่จะกระตุ้นการเจริญด้วยการใช้สารควบคุมการเจริญ ได้แก่ ออกซินและไซโทไคนินซึ่งจะสามารถชักนำให้เนื้อเยื่อถาวรกลับมามีสมบัติเป็นเนื้อเยื่อเจริญได้ใหม่และแบ่งเซลล์เจริญเติบโตได้อีกครั้ง ส่วนต่าง ๆ ของพืชโดยทั่วไปประกอบด้วยเซลล์ที่มีโครโมโซม ๒ ชุด (2n) แต่ในบางส่วนของเนื้อเยื่อและบางระยะ ของการเจริญเติบโตของพืชจะมีการสร้างเซลล์สืบพันธุ์ที่มีจำนวนโครโมโซมลดลงครึ่งหนึ่ง ได้แก่ เซลล์ในอับเรณูและเซลล์ในออวูลภายในรังไข่ที่ยังไม่ได้รับการผสม เซลล์เหล่านี้เมื่อนำมาเลี้ยงจะมีโอกาสได้ต้นพืชที่มีจำนวนโครโมโซมลดลงครึ่งหนึ่ง สำหรับรากและส่วนที่เจริญใกล้ดินตลอดจนส่วนอื่น ๆ ที่มีผิวไม่เรียบหรือมีขนปกคลุมนั้นจำเป็นจะต้องระมัดระวังเรื่องการปนเปื้อนจากจุลินทรีย์เป็นกรณีพิเศษ ตรงข้ามกับส่วนของพืชที่อยู่ภายในหรือมีโครงสร้างบางอย่างห่อหุ้มไว้ เช่น เมล็ดที่อยู่ภายในผลเนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอดซึ่งมีใบอ่อนหุ้มอยู่เป็นชั้น ๆ ส่วนที่อยู่ภายในมักสะอาดกว่าส่วนที่สัมผัสกับภายนอก
ในกรณีที่ต้องการเลี้ยงโพรโทพลาสต์เพื่อวัตถุประสงค์ในการรวมโพรโทพลาสต์หรือแทรกใส่สารพันธุกรรมหรือยีน (gene) เข้าไปในโพรโทพลาสต์จะมีขั้นตอนของการเตรียมโพรโทพลาสต์ โดยอาจเตรียมจากการนำใบที่ผ่านการฟอกฆ่าเชื้อแล้วมาลอกผิวใบที่มีไขเคลือบอยู่ออกไปหรือใช้ใบหรือกลุ่มเซลล์ที่เลี้ยงในสภาพปลอดเชื้ออยู่แล้วตัดให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ แช่ในสารละลายที่มีเอนไซม์ย่อยผนังเซลล์และมีการปรับสภาพเพื่อป้องกันไม่ให้โพรโทพลาสต์แตก โดยเอนไซม์จะย่อยผนังเซลล์ซึ่งอยู่ภายนอกผลที่ได้ คือ โพรโทพลาสต์ที่มีเพียงเยื่อหุ้มจะถูกคัดแยกไปเลี้ยงในอาหารที่เหมาะสมเพื่อใช้ตามวัตถุประสงค์ต่อไป
